要用到的試劑：PBS、medium、Trypsin、cell dye、FBS、DMSO
目前已有很多的化學化合物曾被單獨或混合使用為冷凍保存菌種的抗凍劑，這些抗凍劑能控制冰晶的大小及形成速率，能緩和溶質的濃度的急速增高及增加細胞膜的水滲透性，並降低細胞內容物的凝結點，以利冷凍時細胞脫水的進行。
細胞深低溫保存的基本原理是：在－79C以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處於完全停止狀態，故可以長期保存。
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重點
- 實驗前的準備
- 1.解凍容器，把冰盒拿出來退冰目的:避免盒子太冰，細胞會瞬間凍壞要退冰多久?一定要退到室溫，建議至少提前 30 分鐘拿出來退冰比較保險
- 2.準備 PBS、medium、trypsin步驟:
- 準備 PBS、medium、trypsin
- 噴酒精消毒瓶子外圍 (避免污染)，用紙巾擦乾
- 放到工作台
- 鬆開瓶蓋 (方便單手操作，注意: 不可以將蓋子完全打開放旁邊，避免污染)
- 開始實驗
- 3.把原來的 medium 吸掉目的:
- 舊的培養液裡面有廢物和死細胞 (保證品質和避免污染)
- 要換成抗凍的培養液
實驗步驟:- 拿細胞
- 要換新的 tip，避免污染
- 把原來的 medium 吸到廢物桶
- 4.PBS wash，吸掉目的:將舊的 medium 和廢物洗乾淨實驗步驟:
- 吸取 3ml PBS
- 沿著 dish 壁加入 (為了避免直接沖到細胞)
- 加入後，蓋上蓋子輕輕旋轉，使 PBS 充分 rinse 所有細胞
- 吸掉 PBS
- 吸取 3ml PBS
- 5.把細胞切下來實驗目的將細胞從 dish 上切下來實驗步驟
- 加 1 ml trypsin (直接「散佈」加在 dish 底部)
- 旋轉 dish，確保細胞都有接觸到 trypsin
- 放 37oC incubator 5 min (注意不要放太久)
- 利用空檔標示凍細胞要用的 tubes
- 加 1 ml trypsin (直接「散佈」加在 dish 底部)
- 6.從 dish 中取出 cell
- 從 incubator 拿出剛剛的 dish
- 加 2 ml medium
- 沖一沖 dish，mix 均勻
特別注意:
dish 傾斜 + 來回沖、吸的動作，確保將 cell 沖下來
- 把 medium + cell 裝到 15ml 離心管
- 以下尚未編輯
- 7.低速離心5 min，吸掉上清液
- 8.加1 ml medium，數細胞，取約10^6個細胞
- 9.800 ul細胞+ 100 ul FBS加進凍細胞tube
- cell+ medium + FBS + DMSO = 1ml
- 10.加100 ul DMSO (要避光)
- Tube放進冰盒，冰到 -80℃
檢核清單