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    Western Blot - Sample preparation [Video from GeneTex]
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Western Blot - Sample preparation
Duration: 02:34, Browse: 1889, Last Updated: 2018-12-19
重點
  1. 蛋白質的萃取
  2. 1.
    分離清液與沉澱物
    將 lysis buffer 300μl(內含protinase inhibitor)加入放置於 4℃ 冰鎮之脊髓標本 Ependrof tube,並以 Microson 機器打碎及sonication標本成均質液體,再用超高速離心方法(4℃下以 65000 至 70000 rpm之速度,離心 35 分鐘);其後分離出上清液與沉澱物,丟棄沉澱物,留下上清液。
  3. 2.
    定量蛋白質含量
    此上清液(含蛋白質),以 modified Bradford method 定量蛋白質含量(以 Bio-Tek Elx800 分析吸光值,來測定各標本之蛋白質量)。
  4. 3.
    置入蛋白質總量之標本
    將經校訂後取等體積與等蛋白質總量之標本(50或100μl),置入 sample collecting tubes 內,再加入同體積的 Tricine SDS sample buffer,於 95℃ 下加熱 15 分鐘後,於 4℃ 下離心(7000rpm),等待應用 loading 在 SDS-PAGE gel 上。
  5.  
     
    Tricine Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)膠體之準備
  6. 4.
    配置7﹪的分離膠體(separation gel for NOS)
    將30﹪Acrylamide solution 3.5ml,DDW 1.5ml,3M pH8.45 Tris –HCl 5ml,40﹪glycerol 5ml,10﹪Ammonium persulfate 75μl及TEMED 7.5μl混合均勻後;立即注入注膠器之玻璃板間,並於其上層注入100﹪酒精,使其表面平整,靜置至膠體硬化後,再將上層酒精倒出吸乾。
  7. 5.
    配置10﹪的分離膠體(separation gel for COX-2)
    將30﹪Acrylamide solution 5ml,3M pH8.45 Tris –HCl 5ml,40﹪glycerol 5ml,10﹪Ammonium persulfate 75μl及TEMED 7.5μl混合均勻後;立即注入注膠器之玻璃板間,並於其上層注入100﹪酒精,使其表面平整,靜置至膠體硬化後,再將上層酒精倒出吸乾。
  8. 6.
    注入配置好的5﹪聚積膠體(Stacking Gel:30﹪Acrylamide solution 0.5ml,3M pH 8.45 Tris –HCl 1.25ml,DDW 2ml,10﹪Ammonium persulfate 25μl及TEMED 5μl)
    於分離膠體上層,迅速插入0.75mm,10 wells之comb,來製備樣品槽,之後靜置至膠體凝固。
  9. 7.
    完全聚合後
    小心將 comb 拔出,再將 sandwich clamp assemblies 放入電泳槽中,加入10X Tricine SDS / electrophoresis buffer(Tris base 121g,Tricine 179g,SDS 10g,add DDW to final 1000ml),觀察無洩漏情況後,即完成膠體與電泳槽之製備。
     
  10. (僅模擬資料,資料來源: http://p5a2u2l6.pixnet.net/blog/post/30322139)
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Folder name
western blot (西方點漬法)
Author
系統管理者
Branch
台灣數位學習科技
Created
2018-12-18 09:43:28
Last Updated
2018-12-19 07:14:35
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Duration
02:34
Reference
1
Source
https://www.youtube.com/watch?v=WDqGQaV7Q60&index=2&list=PL9MMxtqzXYVLy74oC1BiAIiRuNLDCd43u